mRNA疫苗的體外穩(wěn)定性
正如之前在背景介紹中提到的,目前已批準(zhǔn)的 mRNA疫苗流通的主要障礙之一是它們必須以冷凍形式儲存。在 2–8 °C 的溫度下,輝瑞/BioNTech 和 Moderna 疫苗分別可穩(wěn)定保存 5 天和 30 天,兩家公司都為終端使用提供了詳細(xì)的處理說明。有趣的是,據(jù)報(bào)道 CureVac 的候選疫苗在冰箱溫度和 -60 °C 下可穩(wěn)定 3 個(gè)月。這些是目前發(fā)布了mRNA-LNP長期儲存條件的制造商,這種苛刻的溫度要求嚴(yán)重影響了這些疫苗的儲存、運(yùn)輸和流通。然而,迄今為止,在公開資料中幾乎沒有關(guān)于優(yōu)化mRNA 疫苗穩(wěn)定性的信息。本節(jié)旨在概述影響 mRNA-LNP 疫苗成分穩(wěn)定性的因素,并討論分析評價(jià)這種穩(wěn)定性的方法。
mRNA穩(wěn)定性
強(qiáng)烈影響所需儲存條件的主要因素是 mRNA 的穩(wěn)定性。如上文2.1 節(jié)所述,mRNA 分子的結(jié)構(gòu)經(jīng)過專門設(shè)計(jì)可以用于增加體內(nèi)靶抗原的翻譯。mRNA 的特殊性在于,即使是長 mRNA 鏈(通常長度在 1000 到 5000 個(gè)核苷酸之間)中的一個(gè)核苷酸發(fā)生變化(鏈斷裂或堿基氧化)便會導(dǎo)致翻譯終止。這使得 mRNA 疫苗與其他疫苗*不同,在其他疫苗中,抗原的微小變化不一定對其功效產(chǎn)生顯影響。因此,對于 mRNA 疫苗,監(jiān)測整個(gè)分子的完整性是至關(guān)重要的。
mRNA 降解的方式有多種,可以分為化學(xué)和物理降解。化學(xué)降解包括 mRNA 分子中化學(xué)鍵的改變。物理不穩(wěn)定性包括變性(二級和三級結(jié)構(gòu)的喪失),與變性對蛋白質(zhì)生物制劑活性的影響不同,物理不穩(wěn)定性對mRNA的影響可能不太明顯。然而,變性還包括聚集和沉淀等變化,這些變化會影響mRNA的翻譯表達(dá)。在一篇關(guān)于核酸穩(wěn)定性的綜述中,Pogocki 和 Sch?neich 指出化學(xué)降解在siRNA降解中的影響比物理不穩(wěn)定性更大,對于鏈長更長的 mRNA來說可能更是如此。
mRNA在體外的化學(xué)降解主要包括水解和氧化,水解主要是發(fā)生在mRNA 分子骨架的磷酸二酯鍵(圖5 )。核糖上的2' OH 基團(tuán)起著至關(guān)重要的作用,因?yàn)閷?dǎo)致 mRNA 鏈斷裂的酯交換反應(yīng)起始于磷酸酯鍵上的 2'OH 基團(tuán)的親核進(jìn)攻導(dǎo)致 P-O5' 酯鍵斷裂(圖5)。這個(gè)過程需要水,可以被核酸酶催化,也可以被 mRNA 分子本身和其他外源因素如酸和堿催化。在有關(guān) mRNA 水解的兩篇文獻(xiàn)中,作者指出 mRNA 的堿基序列和二級結(jié)構(gòu)會影響水解速率。具體而言,堿基堆積可能會降低磷酸二酯鍵的裂解速率,可以小化 mRNA 分子的“平均未配對概率"。可以使用專門設(shè)計(jì)的算法來選擇可以形成大雙鏈區(qū)域的單鏈 mRNA 的核苷酸序列。據(jù)稱,采用這種方法優(yōu)化后,體外穩(wěn)定性得到了改善。
CureVac、輝瑞/BioNTech 和 Moderna 疫苗之間的區(qū)別在于后兩者具有 1-甲基-假尿苷的單核苷摻入。之前的一項(xiàng)研究表明,這種修飾提高了 RNA 二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。CureVac 采用提高GC比例策略,具有類似的效果。
圖5 通過 2',3'-環(huán)狀磷酸酯,堿基催化RNA分子內(nèi)的磷酸二酯鍵水解、B表示Br?nsted堿。
相反,氧化會影響堿基,并在較小程度上影響mRNA 核糖單位的糖基團(tuán)。氧化可導(dǎo)致堿基裂解、鏈斷裂和 mRNA 二級結(jié)構(gòu)的改變。然而,如前所述,水解似乎被認(rèn)為是驅(qū)動 mRNA 降解的關(guān)鍵因素。